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羧甲基纤维素钠对公猪精液常温保存效果的影响

张家庆1,陈东峰2,王献伟3,王璟1,陈俊峰1,蔺萍1,盛卫东1,白献晓1,邢宝松1*

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1.哪能下载hga010|官网农业科学院畜牧兽医研究所,河南 郑州 4500082.广西大学动物繁殖研究所,广西 南宁 5300043. 哪能下载hga010|官网畜牧总站 河南 郑州 450008?

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摘要在猪人工授精技术中,良好的稀释剂是提高猪精子质量的关键因素之一。为探讨羧甲基纤维素钠(CMC)对公猪精液常温保存效果的影响,本研究以传统的公猪精液保存稀释Zorlesco-BSA为基础稀释液,通过添加不同浓度的CMC0816 24 μmol/L)对原精液进行稀释和保存。采用计算机辅助精液分析仪(CASA)检测公猪精子活率和活力,低渗肿胀法(HOST)检测精子质膜完整性,考马斯亮蓝染色检测精子顶体完整性。结果显示,在公猪精液保存的前3 d内,添加不同浓度CMC组的精子活率与对照组相比较高,但差异不显着(P 0.05); 保存47 d时,与对照组相比添加16 μmol/L CMC组的精子活率明显升高(P 0.05);在保存的前2d内,添加不同浓度CMC组的精子活力与对照组相比差异不显着(P 0.05),但在保存至37 d时,添加16 μmol/L CMC组的精子活力显着高于对照组(P 0.05);在保存的前4 d内,添加不同浓度CMC组的精子质膜完整率与对照组相比差异不显着(P 0.05),但在保存至57 d时,添加16 μmol/L CMC组的质膜完整率显着高于对照组(P 0.05);在保存前4 d内,添加不同浓度CMC组的顶体完整率与对照组相比差异不显着(P 0.05),但保存至57 d时,添加16 μmol/L CMC组的顶体完整率显着高于对照组(P 0.05)。结果表明,Zorlesco稀释剂中添加824 μmol/LCMC 能显着改善和提高猪精子活率、活力、质膜完整性以及顶体完整率,其最佳添加浓度为16 μmol/L CMC可作为精液稀释剂中的悬浮剂,用于减缓精子沉降速率,提高猪精液保存质量。

关键词:羧甲基纤维素钠公猪精液;常温保存 ?

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Effects of Carboxymethylcellulose Sodium on Quality of Boar Semen Stored at Room Temperature

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ZHANG Jia-qing1, CHEN Dong-feng2, WANG Xian-wei3, WANG Jing1, CHEN Jun-feng1, LIN Ping1,SHENG Wei-dong1,BAI Xian-xiao1, XING Bao-song1

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(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Academy of Agricultural SciencesZhengzhou 450008, China; 2. .Animal Reproduction Institute, Guangxi University, Guangxi Nanning 530004,China; 3. Henan Provincial Animal Husbandry General Station, Zhengzhou 450008, China)

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Abstract ?Good diluent is one of the key factors to improve the quality of porcine sperm in artificial insemination of swine. In order to investigate the effect of carboxymethylcellulose sodium (CMC) on the quality of porcine semen at room temperature, CMC was added at concentrations of 816 and 24 μmol/L CMC to the extender of Zorlesco-BSA. Boar sperm viability, motility, membrane integrity and acrosomal completion were detected by Computer-assisted semmen analyzer (CASA), Hypo-osmotic swelling test (HOST), and Coomassieblue staiing, respectively. The results showed that Zorlesco as basic dilution appended with 824 μmol/L CMC could increased the sperm viabiliy compared to the control group within the first 3 d in semen preservation, but no obvious difference, the sperm viabiliy in treatment group with 16 μmol/L CMC was significantly improved compared with the control group within 4~7 d. Compared with the control group, the sperm motility in treatment groups with 824 μmol/L CMC had no obvious difference within the first 2 d, but the sperm motility in treatment group with 16 μmol/L CMC was significantly increased compared with the control group within 3~7 d. The sperm plasma membrane integrality in treatment groups with 824 μmol/L had no obvious difference within the first 4 d compared to the control group, but the plasma membrane integrality in treatment group with 16 μmol/L CMC was significantly improved compared with the control group within 5~7 d.The results showed that Zorlesco with 824 μmol/L CMC can improve boar sperm viability, motility, plasma membrane integrality and acrosome integrality, and the Zorlesco with 16μmol/L CMC was the best. In conclusion , CMC can be used as a suspending agent in semen diluent to slow down the sedimentation rate of sperm and improve the quality of porcine semen stored at room temperature.

Key words : CMC; boar semen; room temperature

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为了有效地开展猪人工授精技术,精液稀释保存是关键技术。猪精液冷冻技术虽已成功,但程序复杂、设备昂贵、成本高、并且受胎率偏低,目前尚未广泛推广应用。而猪精液的低温保存时间短、效果差等。所以,猪精液的常温保存(1618)是目前猪人工授精技术普遍采用的方法。国内外很多研究人员为此也开展了大量研究工作,并已研发出多种不同保存时效的精液稀释粉,包括短效、中效和长效稀释粉[1, 2]。常温保存具有很多优点,如保存时间长、活力高、成本低、使用方便等,然而猪精子在长时间放置中会因活动减弱而出现沉淀聚集,造成精子缺氧环境,引起精子窒息死亡,这一直是影响猪精子常温保存的一个关键性问题。近年来,悬浮剂如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙烯醇(PVA在精液保存中应用较多,并取得了较好效果。James[3]研究表明,在稀释液中添加0.4%PVP可提高低温保存后人类精子的受精能力。周佳勃[4]研究报道,在ZORLESCO稀释液中添加聚乙烯醇PVA可提高猪精子在室温保存后的质量。赵本田等[5]研究发现,在山羊精液保存中,在Androhep 稀释液中添0.5% PVA 能明显提高精液保存效果。最近,陈东峰等[6]研究报道,在ZORLESCO中添加0.4% PVA0.4% PVP均能显着提高猪精液在17℃保存后的效果。羧甲基纤维素钠(CMC)又名纤维素胶,具有独特的悬浮、稳定、增稠特性,且其来源丰富,价格便宜。酸性乳中加入CMC可有效防止酪蛋白在酸性条件下的聚集、沉淀以及由此产生的乳清分离,使酸性乳饮料在一定时期内保持均一、稳定的分散体系。CMC 作为稳定剂、增稠剂和乳化剂等,在我国被广泛用于冷饮、果汁、酸性乳、酸奶、冷食、方便面等众多食品中[7-9]。稀释液中添加一定量的CMC有可能减缓精子沉降速度,延长沉淀时间,减少摇匀次数,提高保存质量。本试验旨在探讨CMC对猪精液常温保存的效果,以提高公猪精液在常温保存后的质量。?

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1 材料与方法

1.1 精液来源

?? ?试验所用公猪精液由扬翔公司公猪站提供,精液采自3头体格健壮、性欲旺盛成年大白公猪(12岁)。手握法采集中段浓缩部分,经滤纸过滤后置于保温杯中,所采精液原精活力镜检达0.8以上,精液气味和色泽正常者供稀释保存用。

1.2 试剂

?? 葡萄糖、EDTA、柠檬酸、柠檬酸三钠、氯化钾、碳酸氢钠、TrisL-半胱氨酸,上海国药集团化学试剂有限公司;氧氟沙星,哈药集团制药总厂;蒸馏水,实验室自备。

1.3 仪器及用品

?? 电子恒温水浴锅、精子图像分析仪(CASA)、17恒温箱、温度计、电子天平、相差显微镜等。

1.4 稀释液配制

?? 用电子天平准确称量各种试剂后, 配制成基础稀释液Zorlesco-BSA)。以配制的基础稀释液为对照组,试验组共分为3: 8μmol/L16μmol/L24 μmol/L CMC

1.5 精液稀释与保存

?? 将采集的公猪精液与稀释液在水浴锅内(3033)平衡10 min,再将稀释液沿着瓶壁或玻璃棒缓慢倒入精液中,期间需轻轻摇动或沿一个方向搅拌,混合均匀。稀释后的精子密度为35千万/mL,再将稀释好的精液分装到已灭菌的2mLEP管中,每个试验样品分装10管以便用于后续检测,然后在室温2225缓慢降温至17 最后放入17恒温箱中避光保存。

1.6 精子活率和活力检测

?? 检测时先将从恒温箱中取出的精液放置3335的水浴锅中预热20min,然后用移液枪随机吸取35μL精液样本滴在载玻片上,盖上盖玻片,待液体停止流时,采用计算机辅助精液分析系统(computer-assisted semen analysis, CASA)38检测猪精子活率和活力。

1.7 精子质膜完整性检测

?? 精子低渗溶液的配制:1.3512 g果糖和0.7352 g二水柠檬酸钠溶于100mL去离子水中。采用低肿胀法(HOST)进行检测:取5μL液放入1mL低渗液中混匀。经过30 min孵育后,取5μL精液滴在血细胞计数板上,在400×相差显微镜下观察精子尾部情况,分析精子质膜情况,每次计数200个精子,计算精子弯尾率。

1.8 精子顶体完整性检测

顶体完整率用用考马斯亮蓝液染色镜检:取100μL精子用1mL 3.7%多聚甲醛溶液固定10min2000r/min离心6min,在用PBS离心洗2次并去上清。取30μL涂片,风干。把涂好的载玻片放入含有考马斯亮蓝的染液中,在37染色1h。然后用蒸馏水冲洗,风干,最后在显微镜油镜下观察,每次计数200个精子,计算顶体完整率。

1.9 统计分析

本研究中所有数据均以(平均值 ± 标准误)表示,所获数据进行反正弦转换,利用SAS 8.1版的一般线形模型 Duncan' s 多重比较进行分析。判断标准以P < 0.05 表示差异显着,P < 0.01表示差异极显着,所有试验至少重复10次以上。

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2.结果与分析

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2.1稀释液中添加不同浓度CMC对精子活率的影响

由表1可知,精液在保存的前3 d内,添加不同浓度CMC组与对照组相比精子活率略高,但差异不显着(P 0.05)。精液保存至47 d时,与对照组相比添加16 μmol/L CMC组的精子活率较高且差异显着(P 0.05),而添加8 μmol/L24μmol/L CMC组与对照组相比差异不显着(P 0.05)。在精液保存的7 d内,添加不同浓度CMC各组之间精子活率差异不显着(P 0.05),但从17保存后的效果来看,精子活率在添加16 μmol/L CMC组要优于8 μmol/L24 μmol/L组。

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1 不同浓度CMC对猪精子17℃保存后活率的影响 活精子数

Table1 Effects of different concentrations of CMC on viability in extended semen during long-term storage

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保存时间

Storage

periods

精子活率/% ?Viability

对照组

Control group

8 μmol/L

Group 1

16 μmol/L

Group 2

24 μmol/L

Group 3

0

95.35a±0.96

95.57a±1.23

95.75a±1.28

95.25a±1.25

12h

91.67a±2.01

93.65a±1.35

93.38a±1.29

93.25a±1.42

1d

89.89a±2.05

90.47a±1.24

91.32a±1.34

91.67a±1.24

2d

86.97a±2.21

88.50a±1.52

89.52a±1.08

88.54a±1.37

3d

84.52a±1.18

86.56a±1.28

87.32a±1.27

86.52a±1.13

4d

82.07a±1.27

84.68ab±2.02

86.35b±1.28

84.59ab±1.27

5d

77.42a±1.23

80.35ab±2.15

83.52b±1.37

81.53ab±1.52

6d

75.08a±2.29

77.20ab±2.24

82.45b±1.25

79.46ab±1.51

7d

73.02a±2.01

74.57ab±1.83

80.35b±1.08

77.28ab±1.35

: 同行肩标不同小写字母表示差异显着(P 0.05);下同。

Note: different lowercase alphabets in superscript in each row show significant differencesP 0.05);The same below.

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2.2稀释液中添加不同浓度CMC对精子活力的影响

由表2可知,精液在保存的前2d内,添加不同浓度CMC组与对照组相比较精子活力差异不显着(P0.05)。精液保存至37 d时,添加16μmol/L CMC组精子活力显着高于对照组(P 0.05);与对照组相比,添加8 μmol/L 24 μmol/L CMC组精子活力差异不显着(P 0.05)。在精液保存的7d内,精子活力在添加不同浓度CMC各组之间差异不显着(P 0.05),但从17保存后的效果来看,添加16 μmol/LCMC组精子活力要优于8 μmol/L24 μmol/L CMC组。 ?

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2不同浓度CMC对猪精子17保存后活力的影响

Table 2 Effects of different concentrations of CMC on motility in extended semen during long-term storage

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保存时间

Storage

periods

精子活力/%? Motility

对照组

Control group

8 μmol/L

Group 1

16 μmol/L

Group 2

24 μmol/L

Group 3

0

73.28a±1.06

72.42a±1.36

73.24a±1.86

71.94a±1.35

12h

69.84a±2.02

69.82a±1.56

71.05a±2.08

67.85a±1.85

1d

65.25a±1.62

67.49a±1.33

69.25a±1.47

66.56a±1.46

2d

63.57a±1.08

64.56a±1.52

67.57a±1.58

63.25a±1.25

3d

57.54a±2.03

61.24ab±1.53

64.35b±1.57

61.56ab±1.26

4d

54.76a±2.05

58.05ab±1.35

61.05b±1.26

57.68a±1.65

5d

50.25a±1.63

56.05ab±1.34

58.25b±1.52

56.34ab±2.39

6d

49.08a±1.31

53.26ab±1.05

55.68b±2.25

52.65ab±2.58

7d

46.75a±2.06

50.42ab±1.75

52.16b±2.57

51.35ab±2.37

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2.3稀释液中添加不同浓度CMC对精子质膜完整性的影响

3可知,精液在保存前4d内,添加不同浓度CMC组与对照组相比质膜完整率差异不显着(P0.05)。精液保存至57 d时,添加16 μmol/L CMC组质膜完整率显着高于对照组(P 0.05);与对照组相比,添加8 μmol/L24 μmol/L组质膜完整率差异不显着(P 0.05)。 在保存的7 d内,质膜完整率在添加不同浓度CMC各组之间差异不显着(P 0.05)。

3不同浓度CMC对猪精子17保存后质膜完整性的影响

Table 3 Effects of different concentrations of CMC on integral membrane rate in extended semen during long-term storage

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保存时间

Storage

periods

精子质膜完整性/% Integral membrane rate

对照组

Control group

8 μmol/L

Group 1

16 μmol/L

Group 2

24 μmol/L

Group 3

0

66.53a±1.52

65.24a±1.43

64.58a±1.32

63.40a±1.31

12h

64.28a±2.20

64.42a±2.03

63.59a±1.37

63.52a±2.52

1d

61.34a±1.30

62.52a±2.47

61.82a±1.53

62.28a±1.24

2d

60.25a±1.48

61.89a±2.22

61.02a±1.61

61.53a±1.21

3d

57.24a±1.23

58.28a±1.23

60.02a±1.11

60.56a±1.23

4d

54.08a±2.13

56.53ab±1.45

57.53a±1.04

57.52a±1.16

5d

52.02a±1.36

54.59ab±1.28

56.52b±1.27

54.24ab±1.08

6d

47.21a±1.35

50.27ab±1.45

53.21b±1.42

51.28ab±1.31

7d

43.24a±1.62

47.53ab±1.43

48.82b±1.53

47.52ab±1.41

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2.4稀释液中添加不同浓度CMC对精子顶体完整性的影响

由表4可知,随着精液保存天数的增加精子顶体完整率明显下降;在保存前04 d内,添加不同浓度CMC组与对照组相比,顶体完整率差异不显着(P 0.05)。在保存至57d时,添加16μmol/L CMC组顶体完整率显着高于对照组(P0.05);与对照组相比,添加8 μmol /L24 μmol /L CMC组顶体完整率差异不显着(P 0.05)。在保存的7d内,顶体完整率在添加不同浓度CMC各组之间差异不显着(P0.05)。

4 不同浓度CMC对猪精子17保存后顶体完整率的影响

Table 2 Effects of different concentrations of CMC on integral acrosomal rate in extended semen during long-term storage

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保存时间

Storage

periods

?精子顶体完整率 /% integral acrosomal rate

对照组

Control group

8 μmol/L

Group 1

16 μmol/L

Group 2

24 μmol/L

Group 3

0

92.23a±1.01

91.20a±1.31

92.20a±2.13

90.32a±1.56

12h

89.21a±1.41

89.52a±1.28

90.10a±2.24

88.56a±2.04

1d

85.41a±2.21

86.23a±2.21

88.20a±2.26

85.13a±1.24

2d

83.53a±1.40

83.40a±2.17

86.35a±3.21

84.86a±2.50

3d

78.54a±2.08

81.10a±1.20

83.46a±1.21

80.67a±1.13

4d

75.71a±2.23

77.20a±2.07

80.28a±2.08

79.52a±1.04

5d

72.50a±1.43

75.40ab±2.13

77.70b±2.14

76.34ab±2.42

6d

69.72a±2.13

72.35ab±2.07

74.21b±1.27

73.28ab±2.21

7d

66.16a±2.27

69.24ab±2.01

72.02b±2.09

70.08ab±1.37

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3 讨论

猪精子质膜和顶体完整性是维持其受精能力的重要因素,如精子质膜受到损伤,会直接导致精子活力和受精能力下降。Yildiz[10]研究表明,质膜完整的精子能够顺利完成获能并通过卵子透明带顺利地完成受精整个过程。Barthelemy[11]研究发现,精子顶体含有顶体蛋白酶复合系统, 在卵子受精过程中,当精卵结合时精子头部会发生顶体反应从而释放出顶体酶,可使卵子透明带糖蛋白水解促使精卵受精,顶体不完整的精子可导致顶体膜上结合的蛋白酶丢失或活性降低,导致受精障碍。本实验研究发现, Zorlesco-BSA)稀释液中添加16 μmol/LCMC保存效果最好,精液稀释保存后精子的质膜完整性和顶体完整率最高。当CMC添加量增加(24 μmol/L)或降低时(8 μmol/L)对精子的保存效果都不是最佳,高浓度的CMC可使稀释液的粘稠度增加不利于精子各项指标的检测,而低浓度的CMC其悬浮效果不是最佳。同时本研究对精子活率和活性等指标检测也表明,添加16 μmol/L CMC能够提高猪精子稀释保存后前3d内的活率和活力。其原因可能是CMC具有良好的悬浮作用和极好的悬浮承托力度,阻止了精子在长期保存中沉淀现象的发生,避免了因沉淀现象而造成精子的缺氧环境,从而减少了细胞毒性,降低了精子脂质和DNA的氧化损伤等。

CMC具有良好的悬浮作用和极好的悬浮承托力度,目前广泛用于食品和饮料中[8, 9]。在稀释液中添加CMC来提高精子保存效果的研究至今鲜有人报道,本研究结果表明,精液稀释剂中添加不同浓度的 CMC8 μmol/L16 μmol/L 24 μmol/L)均能提高17保存中精子的质量,其中以添加16μmol/LCMC组的效果最好。在本试验中我们还发现,精子的沉降速度与稀释液中CMC的添加量与呈负相关,这表明CMC添加浓度越大,精子的沉降速度越缓慢,但添加高浓度的CMC会使稀释液变得非常浓稠,不利于精子质量检测。猪精液在1 61 8常温保存过程中会因精子运动速度变慢或停止运动而出现沉淀现象,从而造成精子的缺氧环境,长时间的缺氧静置会降低精子活力,造成精子窒息死亡[12]。在实际生产中,不论是瓶装的或是袋装的精液,都要从放入冰箱开始,每隔12 h,对其进行摇匀一次(上下颠倒),使沉淀精子悬浮防止因精子沉淀聚集造成的死亡,因精液放置时间一长,就会出现大部分精子沉淀[13]。对于一般猪场来说,可在早上上班,下午下班时各摇匀一次。为了便于监督,每次摇动都应有摇动时间和人员的记录。并且,在给正常发情母猪进行人工输精前,输精人员须对升温的精液进行1次上下摇匀,使休眠沉淀精子与稀释液充分混合,以补充精子所需氧[14]。从本试验的结果来看,添加不同浓度CMC稀释液的保存效果都要好于对照组,猪精液在17保存的Zorlesco-BSA)稀释液中,CMC的最佳添加浓度为16 μmol/L。因此本研究表明,在猪精液稀释液中添加16 μmol/L CMC可减缓精子沉降速度,延长保存时间和提高保存质量。

关于稀释液中添加悬浮剂提高精子保存效果的研究,PVPPVA的应用较多。在人类精子研究方面,James[3]研究表明,在冷冻孵育液中添加 0.4% PVP 能够提高人精子冻精膜脂质流动性恢复到正常水平的百分比。在山羊精子研究方面,赵本田等[5]Androhep 稀释液中添加了不同含量的PVA,结果发现,在添加0.5%PVA中精子保存活力的效果最好。在猪精液研究方面,陈东峰等[6]ZORLESCO稀释液中添加了一定浓度的PVAPVP,结果表明,在稀释液中添加0.4%PVP0.4%PVA保存的效果较好,其中以0.4%PVP保存效果最佳。牛血清白蛋白(BSA)是目前稀释液中常添加的一种精子保护和稳定成分,能有效地改善精子保存后的质量,其添加量大并且成本高,对于目前猪人工授精商业化的应用不切实际。CMC是纤维素的羧甲基化衍生物,成本低、应用范围广,且具有悬浮和稳定作用。稳定剂CMC可与蛋白质颗粒发生静电相互作用,吸附在蛋白质颗粒的表面,提供空间位阻作用维持蛋白在酸性条件下的稳定性,未吸附的CMC通过增加体系的粘度,减缓酪蛋白颗粒的沉降速率,增加酸性乳体系的稳定性[15]。本研究结果表明,在Zorlesco稀释剂中添加16μmol/LCMC 能显着改善和提高猪精子活率、活力、质膜完整性以及顶体完整率,CMC可作为精液稀释剂中的悬浮剂,用于减缓精子沉降速率,提高猪精液保存质量. 虽然本研究表明 稀释液中添加CMC能够提高常温保存的猪精子质量,但关于CMC对精子的保护机制还应进一步探索。

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参考文献

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[4] 周佳勃. 猪精液冷冻及室温保存技术研究 [D]. 哈尔滨: 东北农业大学, 2000.

[5] 赵本田,许常龙. 葡萄糖、果糖、聚乙烯醇及牛磺酸对山羊精液保存的影响[J]. 黑龙江动物繁殖, 2007(5): 9-10.

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